LibRar.Org.Ua — Бібліотека українських авторефератів

Загрузка...

Головна Хімічні науки → Розробка клітинних біоелементів сенсорів та ферментативних методів для аналізу метнолу, етанолу та формальдегіду

рН-чутливих польових транзисторiв (рН-ПТ) для аналізу формальдегіду.

  • Вивчення робочих параметрiв сконструйованих мікробних сенсорних систем.

  • Розробка ферментативних фотометричних методів аналізу етанолу та метанолу із застосуванням алкогольоксидази метилотрофних дріжджів.

    Наукова новизна та практична цiннiсть роботи. Виявлено штами дрiжджiв з метаболічно детермiнованою селективнiстю до формальдегiду, проведено їх аналiз та охарактеризовано природу окислення формальдегiду в клітинах метилотрофних та неметилотрофних дріжджів. Вперше показано роль мітохондріальної альдегіддегідрогенази в окисленні in vivo екзогенного формальдегіду, що може служити одним із механізмів його детоксикації.

    Вперше клiтини неметилотрофних дрiжджiв Candida maltosa та Saccharomyces cerevisiae застосовано як основу бiоелементів чутливих до формальдегіду сенсорів, створено лабораторнi моделi клiтинних бiосенсорiв на основi зазначених вище клiтин та рН-ПТ як трансдукторiв для визначення формальдегiду.

    Розроблено біоелементи О2- і Н2О2-датчиків для аналізу алкоголю на основі пермеабілізованих клітин мутантних штамів метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha.

    Розроблено метод селективного визначення метанолу за формальдегідом, який утворюється у алкогольоксидазній реакції, із застосуванням 4-аміно-3-гідразино-5-меркапто-1,2,4-тріазолу. Аналiтичний метод може бути призначено для контролю стану навколишнього середовища і сертифiкацiї харчових та фармацевтичних продуктiв.

    Безпосередня практична цiннiсть роботи полягає у розробці нових біосенсорних та ферментативних методів аналiзу спиртів (метанолу та етанолу) і формальдегiду та створенні нового біотехнологічного продукту – ферментативного діагностикуму "АЛКОТЕСТ" для визначення алкоголю в біологічних рідинах людини, харчових продуктах та бродильних рідинах. Набір "АЛКОТЕСТ" рекомендовано Фармакологічним комітетом МОЗ України для серійного виробництва.

    Структура та об'єм роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини, результатів та їх обговорення, висновків та списку літератури, який включає 182 найменування. Робота викладена на 126 сторінках машинописного тексту і містить 29 рисунків та 12 таблиць. 3 рисунка та 3 таблиці винесено на окремі сторінки. Список літератури розташований на 18 сторінках.

    Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи автором особисто проаналізовано наукову літературу за темою наукового дослідження. Дисертантом розроблено програму проведення експериментів та підібрано методи вирішення поставлених завдань. Дослідження аналітичних параметрів формальдегідного аналізатора проводилось у співпраці зі співробітниками відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та генетики НАНУ (м. Київ), які є співавторами наукових праць здобувача. Обговорення та аналіз результатів досліджень проведено з науковими керівниками.

    Апробація роботи. Матеріали дисертації доповідались на І установчому (VIII) з'їзді Українського мікробіологічного товариства, (Одеса, 1993), 7-ому міжнародному симпозіумі з генетики промислових мікроорганізмів (Монреаль, Канада, 1994), 2-ому симпозіумі з судово-медичних наук "Кримінальні сліди" (Краків, Польща, 1994), Конгресі "Мікробна фізіологія та генна регуляція" (Гаага, Нідерланди, 1995), VII Українському бiохiмічному з'їзді (Київ, 1997), 19-ому міжнародному спеціалізованому симпозіумі з дріжджів (Брага, Португалія, 1998).

    Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 2 статті, 1 патент України, 1 технічні умови, 10 тез доповідей.


    МАТЕРIАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛIДЖЕНЬ

    У роботi використовували наступні штами мікроорганізмів:

    Hansenula polymorpha 356 (leu2) лінії DL1 (дикий тип), люб'язно переданий для досліджень д-ром Л. П. Тихоміровою (Пущіно, Росiя); H. polymorpha 356-83 (fdh–) – мутант, дефектний за формальдегіддегідрогеназою; H. polymorpha С1 (leu2, fdh–) – сегрегант гібрида 356-83 та leu2 лінії CBS4732; H. polymorpha К-105 (gcr1, cat–) – безкаталазний мутант зі знятою катаболітною репресією (конститутивний синтез алкогольоксидази при рості на глюкозному середовищі); H. polymorpha 33-7-4А (gcr1); Candida maltosa (ade2, дикий тип); Saccharomyces cerevisiae FH4С (дикий тип) з колекції відділу біохімічної генетики Відділення Інституту біохімії.

    Клiтини культивували до середини логарифмiчної фази росту в колбах при 300С на качалці при постiйнiй аерацiї (240 об./хв) у мінеральному середовищi наступного складу, г/л: КH2PO4 – 1; (NH4)2SO4 – 3,5; MgSO4 x 7H2O – 0,5; CaCl2 – 0,1. Середовище містило дрiжджовий екстракт "Дiфко" (0,05%) як джерело мікроелементів та вітамінів. В окремих випадках дріжджовий екстракт додавали у 0,3% концентрації. При необхідності в середовище додавали відповідні фактори росту – лейцин або аденін (0,004%). Як джерело вуглецю використовували окремо 1% (v/v) метанол, 1% (v/v) етанол, 1% (w/v) глюкозу або сумiш 0,2% (v/v) глiцерину з 20 мМ формiатом натрію. Біомасу визначали за мутністю розведених суспензій шляхом їх фотометрування.

    Визначення закислювальної здатності клітин дріжджів проводили при постійному перемішуванні у незабуференій водній суспензії клітин, попередньо відмитих від середовища. рН середовища вимірювали потенціометрично за допомогою іонометра ЕВ-74. Зміни рН реєстрували за допомогою самописця.

    Активності ферментів визначали у безклітинних екстрактах, отриманих руйнуванням клітин у планетарному дезінтеграторі за допомогою скляних кульок. Концентрацію білка визначали за методом Лоурі. Аналіз форміату проводили ферментативно.

    Хімічну пермеабілізацію клітин проводили як описано [Zhang and Wang, 1994] та [Луста и др., 1993]. Ліофільне висушування клітин проводили на промисловому ліофілізаторі на базі Львівського заводу лікарських препаратів.

    Аналіз етанолу, метанолу та формальдегіду здійснювали за допомогою транзисторних елементів виробництва НДІ "Мікропроцесор" (м. Київ), перекисного датчика Model 27 та кисневого датчика Model 5330 виробництва Yellow Springs Instruments (США).

    При розробці методів ферментативного аналізу спиртів використовували алкогольоксидазу, яку виділяли із безклітинного екстракту мутантного штаму H. polymorpha К-105, висолюючи фермент сульфатом амонію.

    РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

    Використання клітин дріжджів мутантних штамів H. polymorpha як біоелементів електрохімічних сенсорів для аналізу спиртів.

    Перспективним об'єктом для створення систем аналізу алкоголю є метилотрофні дріжджі. Вибір метилотрофних дріжджів зумовлений їх здатністю до надзвичайно високого рівня синтезу алкогольоксидази (АО). Це забезпечує інтенсивне поглинання кисню клітинами та продукцією перекису водню в присутності спиртів, що можливо реєструвати за допомогою


  •