LibRar.Org.Ua — Бібліотека українських авторефератів

Загрузка...

Головна Хімічні науки → Розробка клітинних біоелементів сенсорів та ферментативних методів для аналізу метнолу, етанолу та формальдегіду

електрохімічних датчиків.

Ранiше у відділі біохімічної генетики Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАНУ шляхом ступінчатого УФ-мутагенезу був отриманий мутант метилотрофних дрiжджiв Hansenula polymorpha К-105 [Gonchar et al., 1990] із повним блоком каталази та конститутивним синтезом АО в середовищі з глюкозою. Клітини цього штаму продукують перекис водню в присутності етанолу та метанолу. Обробка поверхнево-активними речовинами (бромід цетилтриметиламонію або дигітонін) призводила до підвищення Н2О2-екскретуючої активності безкаталазних мутантних клітин приблизно втричі. Активність продукування перекису водню у перерахунку на 1 мг сухої ваги оброблених клітин складала 1-1,2 мкмоль/хв. Позитивний ефект пермеабілізації пояснюється порушенням бар'єрної функції цитоплазматичної мембрани.

Оскільки у сухому стані біоелементи проявляють найвищу стабільність, вивчались умови приготування сухих клітинних препаратів та вплив деяких речовин на активність АО під час їх висушування та зберігання. Перед ліофілізацією до суспензії клітин додавались наступні сполуки: дульцит, сорбіт, сахароза, інозит. За наявності дульциту, сахарози, інозиту під час ліофілізації зберігалось 100% вихідної активності АО. Сорбіт не проявляв помітного стабілізуючого ефекту – під час висушування активність АО знижувалась на 40-45%, як і у контрольному варіанті без добавок. Показано високу стабільність АО в сухих препаратах клітин: варіант із стабілізатором демонстрував зниження активності в перші 5 діб інкубації при 370С лише на 14-20% і збереження цього рівня активності протягом 3-ох наступних тижнів.

Висока алкоголь-індукована Н2О2-продукуюча активність дозволила використати клітинні препарати штама К-105 як чутливий до спиртів елемент перекисного датчика. Чутливу мембрану формували розміщенням суспензії виготовлених клітинних препаратів між полікарбонатною (зовнішня) та целюлозоацетатною (внутрішня) мембранами. Одержану мембрану типу "сендвіч" закріплювали на чутливій поверхні Н2О2-електроду.

При додаванні розчину спирту до робочої комірки реєстрували амперометричний сигнал. Досягнення стаціонарної фази відгуку займало коло 1,5 хв. Величина сигналу прямо пропорційно змінювалась в межах концентрації 0,4-4,0 мМ для етанолу і 0,05-1,2 мМ для метанолу (рис. 1). Більша чутливість сенсора до метанолу пояснюється кращими кінетичними характеристиками АО по відношенню до метанолу.

Для біоелементів на основі клітин безкаталазного штаму показано, що при проведенні 20-25 аналізів на добу протягом двох-трьох днів відгук зберігається на постійному рівні і поступово зменшується протягом наступних 4 днів до 80% від початкового рівня (рис. 2).

Рис. 1. Залежність величини сигналу клітинного Н2О2-біосенсора від концентрації етанолу (о) та метанолу ().


Для створення біосенсора для аналізу спиртів на основі кисневого датчика, було використано клітини мутантного штаму H. polymorpha 33-7-4A. Певна регуляторна мутація дала змогу підвищити рівень клітинного синтезу АО в середовищі з глюкозою і, таким чином, збільшити швидкість поглинання кисню у присутності алкоголю до 1,3 мкмоль О2/хв мг клітин, що в 4 рази перевищує рівень, характерний для штаму дикого типу.

Максимальне споживання кисню спостерігалось для інтактних клітин, вирощених на глюкозі, при використанні спиртів (метанолу або етанолу) як дихальних субстратів. У присутності глюкози рівень споживання кисню приблизно в 10 разів менший, ніж за наявності спиртів у інкубаційній суміші.

Хімічна обробка клітин поверхнево-активними речовинами (дигітонін або бромід цетилтриметиламонію) сприяє щезанню дихання в присутності глюкози, у той же час дихання в присутності спиртів залишається на високому рівні. Це, очевидно, зумовлено виходом з клітин кофакторів та гліколітичних ферментів, необхідних для окислення глюкози, а індуковане спиртами дихання викликане поглинанням кисню за участю алкогольоксидази, яка зберігає внутрішньоклітинну локалізацію після пермеабілізації клітин.


Рис. 2. Операційна стабільність біоелементів сенсорів на основі клітин H. polymorpha К-105 (o) та H. polymorpha 33-7-4А ().


Отже, введення певних мутацій та хімічна обробка мутантних клітин сприяє підвищенню селективності дихального відгуку клітин. Препарат клітин штаму 33-7-4А було застосовано як селективний елемент О2-датчика для аналізу спиртів. Сухі клітинні препарати штаму 33-7-4А було виготовлено за методикою, описаною для клітин штаму К-105, з використанням сахарози як стабілізуючого агента. Результати дослідження стабільності АО в таких препаратах виявили подібну закономірність, яка спостерігалась для ліофілізованих клітин H. polymorpha К-105. За умов зберігання при 370С у перші 6 днів активність АО поступово знижувалась до 80% від вихідної, а потім залишалась незмінною протягом наступних трьох тижнів.

Клітинні препарати іммобілізували в гелі альгінату кальцію між тефлоновою та полікарбонатною мембранами і закріплювали на чутливій поверхні кисневого електроду. Додавання спирту в робочу комірку сенсора веде до локальної зміни концентрації кисню на чутливій поверхні датчика, що призводить до падіння сили струму. Для відгуку біосенсора характерно, що сигнал розвивався швидше, ніж у випадку Н2О2-електроду, і досягав стаціонарного рівня менш ніж за 0,5 хв.

Лінійний діапазон залежності зміни сили струму від концентрації спирту в аналізованому розчині складав 0,2-1,2 мМ для етанолу і 0,03-0,35 мМ для метанолу (рис. 3). Стабільність біоелемента на основі клітин штаму 33-7-4А подібна до тієї, яка спостерігалась для клітин штама К-105. Величина сигналу не змінювалась протягом двох днів і поступово зменшувалась до 80% від вихідного рівня протягом наступних 4 днів експлуатації (див. рис. 2). Відносна стандартна похибка паралельних вимірювань для обох біосенсорів не перевищувала 7%.


Рис. 3. Залежність величини амперометричного сигналу клітинного О2-біосенсора від концентрації етанолу (о) та метанолу ().


Імовірно, що подальший прогрес у конструюванні селективних біосенсорів для диференційного аналізу спиртів і альдегідів може бути досягнутий створенням мембран із заданою проникливістю (розділення спиртів та альдегідів) або скерованою зміною субстрат-зв'язуючих центрів алкогольоксидази методами білкової інженерії.


Вивчення ферментативної природи окислення екзогенного формальдегіду в клітинах дріжджів.

Порівняно недавно було виявлено сильно виражену здатність інтактних клітин метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha закислювати середовище інкубації у відповідь на внесення формальдегіду. Крім теоретичного аспекту, це явище має прикладний інтерес. Адже висока селективність даного