LibRar.Org.Ua — Бібліотека українських авторефератів

Загрузка...

Головна Хімічні науки → Розробка клітинних біоелементів сенсорів та ферментативних методів для аналізу метнолу, етанолу та формальдегіду

процесу дозволяє розглядати продукцію кислих метаболітів як специфічну клітинну відповідь на наявність у середовищі формальдегіду. Тому було вирішено провести пошук штамів дрiжджiв iз пiдвищеною закислювальною здатністю, індукованою формальдегідом, з метою використання відібраних штамів для створення сенсорiв на основi рН-чутливих польових транзисторів (рН-ПТ) для визначення формальдегіду.

Раніше для метилотрофних дріжджів було показано залежність індукованого формальдегідом закислення інкубаційного середовища від активності ферментів прямого шляху окислення метанолу [Гончар и др., 1994]. Тому очевидним здається твердження, що окислення формальдегіду до мурашиної кислоти каталізує глутатіонзалежна формальдегіддегідрогеназа (ФдДГ) за схемою [Fujii & Tonomura, 1972]:

спонтанно ФдДГ ФДГ

НСНО + GSH GS-CH2ОН HCOOH СО2

Н2О GSH NAD+ NADН(Н+)

NAD+ NADH(H+)

ФДГ – форміатдегідрогеназа HCOO– + H+


Синтез ФдДГ індукується при рості дріжджів у середовищі з метанолом і репресується етанолом і глюкозою [Sahm, 1977]. Тим не менше, мутантні клітини H. polymorpha 356-83 та С1, позбавлені активності ФдДГ, зберігали здатність до формальдегідзалежного закислення середовища (табл. 1). На основі цього було зроблено припущення, що в клітині існує альтернативний, неспецифічний до природи альдегідів фермент, який здатен окислювати формальдегід in vivo. Незважаючи на відсутність ФдДГ (табл. 2) у цих штамів, повного блокування індукованої формальдегідом екструзії мурашиної кислоти у них не спостерігалось. Для штаму дикого типу ефективність викиду протонів варіювала в залежності як від ростового субстрату, так і "індуктора" закислення, тоді як величина швидкості цього процесу мало змінювалась у мутантних штамів метилотрофних дріжджів. Вона складала 18-40% від максимального рівня, характерного для штаму дикого типу при метилотрофному рості, що практично співмірно зі швидкістю закислення середовища клітинами дикого типу в умовах репресії ФдДГ глюкозою і етанолом.

Екструзія протонів із паралельним нагромадженням у середовищі іонів форміату притаманна також і парафінутилізуючим дріжджам Candida maltosa і пекарським дріжджам Saccharomyces cerevisiae (див. табл. 1), хоча у цих видів мікроорганізмів не виявляється характерна для метилотрофів глутатіонзалежна ФдДГазна активність. Виявлено, що клітини цих дріжджів, вирощені на середовищі з етанолом, здатні до інтенсивної екструзії протонів у відповідь на внесення формальдегіду у середовище інкубації. Швидкість закислення позаклітинного простору співрозмірна з величиною, характерною для метилотрофно вирощених дріжджів дикого типу H. polymorpha (див. табл. 1). Як у випадку індукованого формальдегідом закислення клітинами метилотрофних дріжджів H. polymorpha, виділення Н+ клітинами неметилотрофних дріжджів при інкубації з формальдегідом супряжено з викидом форміат-аніонів. Після 5 хв інкубації клітин (1 мг/мл) ферментативним аналізом у середовищі виявлено 0,1-0,15 мкМ форміат.

Одержані результати можна пояснити участю у процесі окислення формальдегіду у метилотрофних дріжджів, крім глутатіонзалежної ФдДГ, іншого ферменту, здатного окислювати формальдегід. Парафінутилізуючі дріжджі C. maltosa та пекарські дріжджі S. cerevisiae, які здатні in vivo окислювати екзогенний формальдегід і екскретувати мурашину кислоту, також володіють подібним ферментом, малоселективним до природи альдегіду. Відповідний фермент тісно пов'язаний з обміном етанолу, оскільки індукується цим спиртом, а вирощені на глюкозному середовищі клітини володіють цією здатністю значно меншою мірою.

Таблиця 1

Залежність швидкості закислення від метаболічного стану клітин дріжджів диких і мутантних штамів та індуктора закислення (M m, n = 5)


Штам

Ростовий субстрат

Питома швидкість закислення,

нмоль Н+ хв-1 мг-1 клітин



формальдегід

бензальдегід

H. polymorpha 356


глюкоза

етанол

гліцерин+

форміат

метанол

4,6 0,32

5,7 0,37


15,9 1,2

17,0 1,4

4,2 0,33

4,0 0,29


-

5,2 0,37

C. maltosa


глюкоза

етанол

1,7 0,13

14,8 1,1

1,4 0,12

14,2 1,1

S. cerevisiae


глюкоза

етанол

1,5 0,11

21,0 1,2

1,2 0,12

20,3 1,3

H. polymorpha 356-83


глюкоза

етанол

гліцерин+

форміат

метанол

3,2 0,23

3,4 0,25


3,6 0,22

3,0 0,18

3,0 0,16

4,0 0,27


-

3,1 0,16

H. polymorpha С1


глюкоза

етанол

гліцерин+

форміат

метанол

4,6 0,33

6,2 0,37


6,6 0,35

5,4 0,28

4,6 0,19

5,3 0,27


-

5,0 0,29

Позначення: "-" – не аналізували.



Таблиця 2

Залежність активності деяких ферментів обміну спиртів та альдегідів від метаболічного стану клітин дріжджів диких та мутантних штамів (M m, n = 5)


Штам

Ростовий субстрат

Питома активність ферментів,

мкмоль. хв-1 мг-1 білка



ФдДГ

ФдР

АдДГ

H. polymorpha 356


глюкоза

етанол

гліцерин+

форміат

метанол

0,042 0,003

0,034 0,002


0,40 0,024

0,58 0,042

0,45 0,014

0,43 0,017


0,45 0,021

0,70 0,029

0,028 0,003

0,044 0,003


0,026 0,011

0,043 0,004

C. maltosa


глюкоза

етанол

0,00

0,00

0,10 0,009

3,12 0,12

0,031 0,004

0,29 0,017

S. cerevisiae


глюкоза

етанол

0,00

0,00

0,15 0,009

5,11 0,13

0,030 0,003

0,56 0,029

H. polymorpha С1


глюкоза

етанол

гліцерин+

форміат

метанол

0,00

0,00


0,00

0,00

2,18