LibRar.Org.Ua — Бібліотека українських авторефератів

Загрузка...

Головна Хімічні науки → Розробка клітинних біоелементів сенсорів та ферментативних методів для аналізу метнолу, етанолу та формальдегіду

0,092

1,61 0,11


1,62 0,093

0,046 0,003

0,050 0,017


0,041 0,015

H. polymorpha 356–83


глюкоза

етанол

гліцерин+

форміат

метанол

0,00

0,00


0,00

0,00

1,21 0,068

1,56 0,060


1,55 0,071

0,030 0,003

0,039 0,004


0,032 0,003

Позначення: ФдДГ – глутатіонзалежна формальдегіддегідрогеназа; ФдР – формальдегідредуктаза; АдДГ – альдегіддегідрогеназа, "-" – не аналізували у зв'язку зі слабким ростом клітин.


Для C. maltosa і S. cerevisiae виявлено зв'язок цього процесу з рівнем активності неспецифічної альдегіддегідрогенази (АдДГ), активність якої значно зростає при рості на середовищі з етанолом (див. табл. 2). На рис. 4 показано, як у процесі росту клітин C. maltosa у періодичній культурі відбувається зміна активності АдДГ, яка корелює з відповідним рівнем закислюючої здатності клітин. Для метилотрофних клітин індукції даного фермента етанолом практично не спостерігалось (див.табл. 2), що відображується в однаковому рівні закислювальної здатності клітин метилотрофних дріжджів, вирощених на цих субстратах.

Рис. 4. Залежність швидкості закислення середовища інтактними клітинами дріжджів C. maltosa та питомої активності АдДГ від фази росту в періодичній культурі (ростовий субстрат – етанол).

Для клітин S. cerevisiae спостерігалась аналогічна залежність.


На основі наведених даних можна припускати, що ферментом, який здійснює окислення екзогенного формальдегіду до мурашиної кислоти, є АдДГ, яка каталізує другий етап утилізації етанолу в клітинах дріжджів. Дріжджова АдДГ має широку субстратну специфічність до альдегідів [Steiman et al., 1968], що відображується у практично однакових рівнях закислення, ініційованого формальдегідом і бензальдегідом, для клітин C. maltosa, S. cerevisiae та мутантних штамів H. polymorpha (див. табл. 1). Цей фермент може розглядатися як компонент системи окислення формальдегіду та екструзії мурашиної кислоти у досліджуваних дріжджів, що служить, вірогідно, формою детоксикації формальдегіду і доповнює уже відомі шляхи забезпечення резистентності клітин дріжджів до екзогенного формальдегіду через необоротне відновлення до метанолу продуктом гену ADH1 [Grey et al., 1996] та його окислення за участю алкогольдегідрогенази, кодованої геном ADH5 [Wehner et al., 1993].


Вивчення робочих характеристик клiтинних бiосенсорiв на основi рН-ПТ для аналізу формальдегіду.

Клiтини C. maltosa i S. cerevisiae, вирощенi на етанолi, володiють сильно вираженою здатнiстю до екструзiї мурашиної кислоти при iнкубацiї їх з формальдегiдом завдяки iндукцiї у клiтин неспецифiчної АдДГ. Метанол у таких клiтин не викликає закислення через вiдсутнiсть фермента, здатного окислювати цю сполуку. Тому клiтини цих дріжджів було застосовано для розробки високочутливого методу аналiзу формальдегiду.

Додавання аналiзованого розчину формальдегіду в робочу комірку сенсора викликало локальне закислення середовища клiтинами, iммобiлiзованими в альгінатному гелі на затворі рН-чутливого польового транзистора. Закислення зумовлено окисленням клітинами формальдегіду до мурашиної кислоти і екструзією її у позаклітинний простір. Локальна зміна рН спричиняє змiну заряду на поверхнi iон-селективної мембрани. На рис. 5 зображено типову криву вiдгуку сенсора, чутливого до формальдегіду. Вона характеризувалась наявнiстю незначного лаг-перiоду. Через 3-5 хв вiдгук досягав

Рис. 5. Характерна крива вiдгуку клiтинного бiосенсора на основi рН-ПТ.

Вимірювання проводили у дистильованiй водi. Концентрацiя клiтин (S. cerevisiae) – 15 мг/мл.


стаціонарного рiвня. Вiдновлення базової лiнiї вiдгуку біосенсора спостерігалось при промиванні протягом 10-20 хв. У зв'язку з вiдносно повiльним розвитком сигналу вимiри проводились у кiнетичному режимi за максимальною швидкістю зміни потенціалу - [dU/dt]макс. На рис. 6 представлено залежність сигналу клiтинного сенсора від концентрації формальдегiду для незабуферених водних розчинiв. Лiнiйна залежність швидкості вiдгуку бiосенсорiв вiд концентрацiї формальдегіду знаходилась в дiапазонi 1-75 мМ напiвлогарифмiчної шкали як при використанні клітин C. maltosa, так i S. cerevisiae. Мiнiмальна концентрація, яку можна визначити, в обох випадках складала 0,3 мМ.

Дослiджено залежнiсть величини вiдгуку мiкробного сенсора вiд кратностi його застосування. Промiжок часу мiж вимiрюваннями не перевищував 20 хв. Операцiйна стабiльнiсть за таких умов складала не менше 5-х годин. Протягом цього часу спостерігалась хороша відтворювальність величин потенцiометричних сигналiв – відносний коефіцієнт варіації вимiрiв при тiй самiй мембранi не перевищував 7%. Стандартне вiдхилення величин потенцiометричних сигналiв для мембран, сформованих на поверхнi перетворювача de novo, складало близько 10%.

Рис. 6. Залежність сигналу клiтинних бiосенсорiв на основi рН-ПТ від концентрації формальдегіду.

Вимірювання проводили у дистильованій воді. Концентрацiя клiтин (1 - S.cerevisiae; 2 - C. maltosa) у бiомембранi – 15 мг/мл.


Величина відгуку клiтинного сенсора сильно зменшувалась при збiльшеннi буферної ємностi аналiзованого розчину, оскільки компоненти буферу, дифундуючи у мембрану з іммобілізованими клітинами, зменшують концентрацiю вiльних протонiв.

Створений бiосенсор є високоселективним по відношенню до формальдегiду. Серед протестованих речовин реєструвався позитивний потенцiометричний сигнал тільки на формальдегід та бензальдегід і негативний – на метанол, етанол, пропанол, бутанол, ізопропанол, лактат, глюкозу.


Розробка ферментативного методу кількісного аналізу алкоголю.

Алкогольоксидаза, крім метанолу, здатна окислювати і інші первинні аліфатичні спирти, зокрема, етанол:


СН3СН2ОН + О2 СН3СН=О + Н2О2

На останній реакції грунтується аналітичне використання АО для визначення етанолу за утвореним перекисом водню. Останній окислює в пероксидазній реакції хромоген до забарвленого продукту (барвника), концентрацію якого вимірюють фотометрично:

Пероксидаза

H2O2 + SH2 S + 2H2O

Хромоген Барвник

Для розробки діагностикуму для ферментативного аналізу етанолу на основі алкогольоксидазно-пероксидазного методу як прототип було відібрано спосiб визначення активності пероксидази iз використанням як хромогена неканцерогенного дигiдрохлориду 3,3',5,5'-тетраметилбензидину (ТМБ) [Holland et al., 1974].

При відробці стандартних умов брались до уваги