LibRar.Org.Ua — Бібліотека українських авторефератів

Загрузка...

Головна Хімічні науки → Розробка клітинних біоелементів сенсорів та ферментативних методів для аналізу метнолу, етанолу та формальдегіду

чутливість, зручний час проведення аналізу (10-25 хв), економічність затрат. При підборі умов визначення етанолу показано, що в режимі "плато" межі аналізованих концентрацій алкоголю зміщуються в область малих значень (0,2-6 мкг етанолу в 4 мл реакційної суміші). Така висока чутливість вносить деяку незручність при рутинних аналізах, бо при цьому більшість зразків потребує додаткового розведення. Кінетичний режим дозволяє адаптувати чутливість методу до конкретних вимог об'єкту (цільна кров, сироватка). У кінцевому варіанті аналізу вміст АО в реакційній суміші складав 0,06 од./мл. Для швидкого перетворення перекису водню, який утворюється в алкогольоксидазній реакції, пероксидаза додавалась в надлишку (за активністю). Як буферну систему було вибрано 50 мМ К-фосфатний буфер, рН 7,0, при якому активність АО є максимальною і добре виражено блакитне забарвлення суміші, що легко ідентифікується візуально.

Фотометрування згідно із розробленим методом здійснювалось при рН 1,8 після додавання соляної кислоти до кінцевої концентрації 0,1 М. Це пояснюється необхідністю зупинки реакції та більшим коефіцієнтом екстинкції продукту окислення ТМБ при низьких значеннях рН. На рис. 7 наведено типову калібрувальну криву для визначення етанолу в модельних розчинах за розробленою методикою. Відтворювальність результатів паралельних вимірювань аналізувалась на модельних сироватках із різним вмістом алкоголю. У залежності від концентрації алкоголю, коефіцієнт варіації паралельних вимірювань коливається від 1% (3,6 г/л) до 12% (0,1 г/л). При концентраціях, що перевищують юридично допустимий рівень (1 г/л), цей параметр не більший 3%.

На основі розробленого методу створено аналітичний набір "АЛКОТЕСТ". Випробування набору проводились на базі лабораторії токсикології Київського НВО швидкої допомоги та медицини катастроф і лабораторії судмедекспертизи Київського гарнізону МО України. Було досліджено проби крові та сироватки 42-х пацієнтів на наявність алкоголю паралельно трьома методами: газо-рідинною хроматографією, алкогольдегідрогеназним (набір фірми "Sigma"), алкогольоксидазним (набір "АЛКОТЕСТ"). Виявлено високу кореляцію результатів одержаних трьома методами (на рис. 8 приводяться дані для двох методів).



Рис. 7. Типова залежність значення оптичної густини від концентрації етанолу в фотометрованій пробі.


Рис. 8. Кореляція результатів аналізу етанолу (г/л), одержаних АО і АДГ методами.

Термін зберігання набору "АЛКОТЕСТ" визначається стабільністю ферментів. Для перевірки терміну придатності один набір витримували при кімнатній температурі (~200С), другий – при 40С. Для першого набору майже повна інактивація (на 95%) відбувалась за 12тижнів. Зберігання при 40С протягом 10 місяців не виявило суттєвої зміни активності ферментів.


Розробка ферментативно-хімічного методу кількісного аналізу метанолу.

Фотометричний метод визначення метанолу за генерованим у алкогольоксидазній реакції перекисом водню не дає можливості розрізнити метанол на фоні етанолу, що актуально в токсикологічній практиці. Тому було застосовано інший підхід при розробці методу аналізу метанолу, а саме, за другим продуктом окислення метанолу алкогольоксидазою – формальдегідом.

Для розробки методу визначення метанолу було вибрано спосiб визначення альдегідів iз використанням 4-аміно-5-гідразино-3-меркапто-1,2,4-тріазолу (АГМТ), який в реакцiї з альдегiдами формує забарвлений продукт [Avigad, 1983]. Спектр поглинання продукту взаємодiї цієї сполуки з формальдегiдом (максимум поглинання при l=548 нм) рiзко вiдрiзняється вiд спектра поглинання продукту реакції з ацетальдегiдом та іншими альдегідами (максимум поглинання при l=349-355 нм). Чутливiсть даного методу дозволяє визначати формальдегід в діапазоні концентрацій 0,5-50 нмоль у 1 мл пробі.


Рис. 9. Калібрувальні криві для визначення метанолу ферментативно-хімічним методом (1 - оптична густина при l=548 нм; 2 - при l=355 нм)

А - у модельних розчинах метанолу;

Б - у суміші метанол + етанол (у співвідношенні 1:10)

Аналіз проводився у напівкінетичному режимі. Реакція зупинялась додаванням лужного розчину АГМТ для розвитку специфічної кольорової реакції на альдегіди. За таких умов за 10 хв. інкубації окислювалось ~30% метанолу при проведенні аналізу в концентраційному діапазоні 0,3-3,0 мкг (~10-100 нмоль) у фотометрованій суміші. У разі наявності етанолу можливість кількісного визначення метанолу у суміші із етанолом зберігалось при їх співвідношенні 1:10 за молярною концентрацією (рис. 9). При таких концентраціях етанол практично не конкурує з метанолом в алкогольоксидазній реакції.


ВИСНОВКИ

  • Вивчено умови стабілізації алкогольоксидази в ліофілізованих препаратах клітин мутантних штамів метилотрофних дріжджів H. polymorpha. На основі виготовлених клітинних препаратів та О2- і Н2О2- електродів сконструйовано модельні клітинні сенсори для аналізу етилового і метилового спиртів та досліджено їх аналітичні характеристики.

  • Проведено відбір штамів метилотрофних і неметилотрофних дріжджів за здатністю до індукованої формальдегідом екструзії протонів інтактними клітинами. Вперше показано, що інтенсивна генерація мурашиної кислоти в присутності формальдегіду відбувається при інкубації інтактних клітин неметилотрофних дріжджів – парафінутилізуючих (Candida maltosa) та пекарських (Saccharomyces cerevisiae).

  • Виявлено тісну кореляцію між процесом закислення та активністю неспецифічної, індукованої етанолом альдегіддегідрогенази, що свідчить про участь цього фермента в окисленні екзогенного формальдегіду.

  • Розроблено лабораторнi моделi клiтинних бiосенсорiв на основi клiтин неметилотрофних дрiжджiв C. maltosa і S. cerevisiae та рН-чутливих польових транзисторiв для кількісного визначення формальдегiду. Вивчено робочi характеристики клiтинних бiосенсорiв на основi рН-ПТ.

  • Розроблено методи ферментативного визначення етилового і метилового спиртів за допомогою алкогольоксидази метилотрофних дріжджів. Метод, який грунтується на супряженій алкогольоксидазно-пероксидазній реакції, покладено в основу впровадженого в практику аналітичного набору "АЛКОТЕСТ" для фотометричного аналізу алкоголю в біологічних рідинах та харчових продуктах.

  • Показано, що використання реакції з 4-аміно-3-гідразино-5-меркапто-1,2,4-тріазолом дозволяє селективно визначати метанол у суміші з етанолом за генерованим в алкогольоксидазній реакції формальдегідом Діапазон вимірюваних концентрацій розробленого метода знаходиться в межах 10-100 нмоль у 1 мл пробі.


    СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

  • Майдан Н.Н., Гончар М.В., Сибирный А.А.


  •