LibRar.Org.Ua — Бібліотека українських авторефератів

Загрузка...

Головна Медицина. Медичні науки → Роль гіпергомоцистеїнемії у динаміці росту злоякісних пухлин (експериментальне дослідження)

міжнародних правил виконання робіт з експериментальними тваринами.

Під час кожної серії досліджень тварини отримували напівсинтетичний повноцінний раціон (НПР) та створені на його основі експериментальні дієти. НПР був слідуючого складу: казеїн - 18%, жир (з жиророзчинними вітамінами) - 10%, целюлоза - 2%, суміш мінеральних солей - 3,5%, суміш водорозчинних вітамінів з глюкозою – 0,5%, крохмаль - до 100%. Суміш вітамінів містила: тіаміну хлорид – 10,0; піридоксину гідрохлорид – 15,0; фолієва кислота – 2,0; ціанокобаламін – 0,03; рибофлавін – 10,0; кальцію пантотенат – 15,0; нікотинова кислота – 100,0; біотин – 0,1; альфа-токоферолу ацетат 350,0; нікотинова кислота – 100,0; філохінон – 5,0; ретинолу ацетат – 5,0; ергокальциферол – 0,03; нікотинова кислота – 100,0; аскорбінова кислота – 375,0; холіну хлорид – 10,0 мг/кг сухого корму.

Хронічну ГГЦ викликали шляхом утримання тварин на НПР з додаванням метіоніну (Fluka) в кількостях від 1% до 4,4% від загальної маси НПР (метіонінова модель ГГЦ) або за умов поєднання у раціоні навантаження метіоніном та аліментарної недостатності вітамінів В6, В9 та В12 (метіонінова вітамін-дефіцитна модель ГГЦ). Для корекції експериментальної ГГЦ використовували слідуючі речовини: комплекс вітамінів В6, В9 та В12 (5-ти або 15-ти кратно збільшені кількості вітамінів по відношенню до їх вмісту у НПР), креатин (1% та 5%), бетаїн (1% та 5%) та холін (0,1% та 0,5%), які додавали безпосередньо у НПР чи вводили у шлунок тварин за допомогою зонду.

Для створення експериментальних модельних систем злоякісного росту були використані наступні перещеплювані штами пухлин: карцинома Герена, карцинома легені Льюїс, карциносаркома Уокер-256, аденокарцинома Са 755, отримані із Банку клітинних культур ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Крім того, були досліджені хімічно індуковані пухлини МЗ у щурів. Індукцію пухлин проводили шляхом одноразового внутрішньоперітонеального введення водного розчину NMU (Sigma, USA) самкам щурів лінії Вістар віком 60-70 днів із розрахунку 50 мг/кг маси тіла (Rose et al., 1980). Перебіг пухлинного процесу характеризували за стандартними показниками: об'єм і маса пухлин; частота та інтенсивність метастазування. Протипухлинний ефект ДОКС ("Еbewe", Аustria) у сумарній дозі 7,5 мг/кг маси тіла тварин оцінювали за відсотком гальмування росту пухлин (ГРП) та коефіцієнтом збільшення тривалості життя (ЗТЖ). Відсоток ГРП визначали через 24 години після останньої ін'єкції ДОКС, а коефіцієнт ЗТЖ – після загибелі усіх тварин. Біологічно значимими вважали: ГРП>50%; ЗТЖ>25% (Софьина З.П. и др., 1979). Антиметастатичний ефект оцінювали за індексом інгібування метастазування (ІІМ) та за відсотком гальмування росту метастазів (ГРМ). Біологічно значимими вважали: ГРМ>25%; ІІМ>25% (Ушморов А.Г., 1989).

В якості критеріїв канцерогенної дії NMU щодо тканини МЗ у щурів використовували загальноприйняті показники: латентний період, гістологічний тип індукованих пухлин МЗ, частота пухлин МЗ у групі, співвідношення між доброякісними та злоякісними пухлинами МЗ, коефіцієнт множинності, маса та об'єм пухлин МЗ у групі (Турусов В.С. и др., 1986).

Концентрацію загального ГЦ у плазмі крові тварин визначали методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) на апараті Hewlett Packard (USA) із використанням колонки Hypersil BDS C-18 за методикою Пентюка О.О. та інш. (2001). В частині досліджень вміст ГЦ у плазмі крові визначали методом імуноферментного аналізу (ІФА) з використанням набору реактивів фірм „Axis-Shield" (UK) та "Dіazyme" (USA) на імуноферментному аналізаторі "Stat Fax 2100" (USA).

Для мікроскопічного дослідження брали пухлинну тканину у 2-3 тварин з кожної групи на 14 добу після перещеплення карциносаркоми Уокер-256, а в експериментах із NMU-індукованим канцерогенезом у МЗ щурів - у кожної тварини-пухлиноносія. Забір гістологічного матеріалу, його фіксацію у 10%-му розчині нейтрального формаліну та подальшу обробку проводили загальноприйнятим методом. Морфологічні дослідження тканини здійснювали на зрізах, фарбованих гематоксиліном та еозином на мікроскопі Laborlux S (Leitz).

Виділення ДНК із тканин печінки та пухлини виконували модифікованим методом Blin et al. (1976), який включає послідовні етапи ферментативного протеолізу, депротеїнізації та переосадження ДНК спиртом. Рівень загального метилювання ДНК визначали по співвідношенню між вмістом 5-метилцитозину та цитозину за методом Pogribny et al. (1999). Для рестрикції геномної ДНК використовували два типи ендонуклеаз рестрикції - метилчутливу HpaII (New England Biolabs, Beverly, MA) та її метилнечутливий ізошизомер MspI (Fermentas, Lithuania). Необроблена рестриктазами ДНК слугувала в якості фонового контролю. Аліквоту рестриктованої ДНК використовували в реакціях ампліфікації. Реакційна суміш (25,0 мкл) містила: 1,0 мкг ДНК, 1X PCR buffer II, 1,0 мM MgCl2, 0,25 одиниць AmpliTaq DNA polymerase (Perkin Elmer, Foster City, CA) та 0,1 мкл [3H]dCTP (57.4 Ci/mmol) (NEN, Boston, MA). Суміш інкубували при температурі 56o C протягом однієї години. В подальшому зразки наносили на іонообмінний фільтрувальний папір DE-81 та тричі промивали 0,5 M натрій-фосфатним буфером (pH 7.0) при кімнатній температурі. Фільтри висушували, переносили у флакони з сцинтиляційною рідиною та знімали показники включення мітки [3H]dCTP у ДНК. Рівень загального метилювання ДНК оцінювали як середнє значення кількості розпадів за хвилину (dpm) на мкг ДНК з урахуванням фонової величини радіоактивності контрольних (необроблених рестриктазами) зразків ДНК.

Статистичну обробку результатів проводили з використанням програми Statistiсa 6.0 та програмного забезпечення (Лапач С.Н. и др., 2002). Для міжгрупових порівнянь результатів використовували параметричні (Стьюдента) чи непараметричні (медіанний та Уайта) критерії. Ступінь кореляційного зв'язку між показниками визначали методом непараметричної рангової кореляції Спірмена (rs). Для дослідження міжгрупової дисперсії використовували багатовибірковий дисперсійний аналіз Фрідмана. Різницю між показниками вважали вірогідною при рівні значимості Р<0,05, а при розрахунках по критерію ч2 (хі-квадрат) - за умов У≥3,8.


РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ


Зміни концентрації ГЦ у плазмі крові та рівня загального тканиноспецифічного метилювання ДНК у тварин з експериментальними пухлинами. Оскільки ріст злоякісних пухлин завжди супроводжується різними метаболічними порушеннями, на першому етапі досліджень було доцільним з'ясувати чи змінюється вміст ГЦ у плазмі крові тварин-пухлиноносіїв і яким чином ці зміни пов'язані із особливостями росту пухлин. З цією метою було використано декілька експериментальних модельних систем злоякісного росту.

В дослідженнях на тваринах із карциномою 3LL встановлено, що на 25-ту добу після перещеплення (стадія експоненційного росту та активного метастазування), вміст ГЦ у плазмі крові тварин-пухлиноносіїв був вірогідно у 3,35 рази вищим за аналогічний показник у плазмі крові тварин із групи інтактного контролю (5,120,28 мкмоль/л), прямо корелював із масою пухлин (rs=0,73; P=0,0009) та зворотно - з кількістю метастазів у легенях (rs =-0,75; P=0,03).

На NMU-індукованій моделі пухлин МЗ у щурів нами було встановлено, що вміст ГЦ у плазмі крові тварин із злоякісними пухлинами МЗ (карцинома, фібросаркома) на