LibRar.Org.Ua — Бібліотека українських авторефератів

Загрузка...

Головна Медицина. Медичні науки → Роль ендогенних лектинів і вуглеводнів в агрегації, адгезії і міграції злоякісних клітин

екзогенних вуглеводів на агрегацію, адгезію і міграцію пухлинних клітин; вплив вуглеводів на взаємодію пухлинних клітин та клітин селезінки.

Методи дослідження – методи експериментальної онкології (виділення пухлинних клітин, біоптатів і клітин селезінки); методи клітинної біології (культивування клітин і біоптатів на міліпорових фільтрах і в дифузійних камерах); імуноцитохімічні методи (метод прямого пероксидазного фарбування і авідін-біотиновий метод); статистичні методи (обробка даних з використанням t-критерію Стьюдента і програми Microcal Origin).

Наукова новизна отриманих результатів. Проведені дослідження дозволили вперше проаналізувати роль ендогенних лектинів і вуглеводів в процесах, що обумовлюють метастазування злоякісних клітин. Вперше виявлені відмінності в експресії ендогенних лектинів на поверхні пухлинних клітин з різним метастатичним потенціалом. Досліджено вплив екзогенних вуглеводів на агрегацію, адгезію і міграцію клітин пухлин з різною здатністю до метастазування. В системі in vitro вперше доведено, що екзогенні вуглеводи здатні пригнічувати процеси, які задіяні в метастазуванні. Вперше встановлено, що ступінь пригнічення корелює з рівнем експресії ендогенних лектинів та суттєво залежить від присутності імуносупресорних клітин селезінки.

Практичне значення отриманих результатів. Здатність деяких екзогенних вуглеводів значно пригнічувати агрегацію, адгезію і міграцію пухлинних клітин з високим метастатичним потенціалом in vitro відкриває нові можливості для розробки засобів пригнічення метастазування in vivo. Оскільки безпосереднє використання екзогенних вуглеводів in vivo є доцільним, але малоефективним через низьку доступність пухлини і метастазів, то створення препаратів, що мають виявлені за попереднім тестуванням in vitro вуглеводні детермінанти і характеризуються високою специфічністю, може сприяти розробці нової антиметастатичної терапії, орієнтованої на конкретного хворого.

Особистий внесок здобувача. При виконанні дисертаційної роботи здобувачем була зібрана та проаналізована література за темою дисертації, поставлено мету та сформульовано завдання, самостійно проведені експерименти, вивчено експресію рецепторів до вуглеводів на поверхні клітин пухлин та вуглеводів до рослинних лектинів на клітинах селезінки, вивчено вплив вуглеводів на агрегацію, адгезію і міграцію клітин пухлин на всіх досліджуваних моделях злоякісного росту (карцинома 3LL, меланома В16 та МХА саркома), самостійно проведені статистична обробка та теоретичне узагальнення результатів досліджень, формулювання основних положень та висновків роботи.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертацийної роботи були представлені на: 50 щорічному симпозіумі з фундаментальних досліджень раку (Хьюстон, США, 1997), конференціях молодих вчених Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАНУ (Київ, 1997, 1999 рр.), ІІ з'їзді онкологів країн СНД (Київ, Україна, 2000).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 7 наукових робіт, з яких 4 статті у провідних фахових журналах, рекомендованих ВАК України, 3 – в тезах конференцій.

Структура та обсягдисертації. Дисертаційна робота обсягом 128 сторінок складається з вступу, огляду літератури, трьох розділів за матеріалами власних досліджень, аналізу результатів дослідження, висновків, списку літератури, що містить 213 джерел, у тому числі 208 закордонні роботи. Робота ілюстрована 16 таблицями і 21 рисунком.


ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ


Матеріали та методи дослідження. Дослідження проведені на мишах-самцях ліній C57BL/6 і BALB/c масою 191 г розведення віварію Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології їм Р.Є. Кавецького НАН України, керуючись міжнародно прийнятими правилами проведення робіт з експериментальними тваринами. В роботі були використані лінійно-специфічні штами спонтанно метастазуючих карциноми 3LL і меланоми В16, які перещеплювали мишам лінії C57BL/6 і неметастазуюча МХА саркома, яку підтримували на мишах BALB/c не більше ніж 5 пасажів. Перещеплення клітин пухлин здійснювали загальноприйнятими методами.

Кількість нейрамінової кислоти в тканині пухлини, міграційну активність і метастазування карциноми 3LL оцінювали на 17, 21, 24 і 28 добу після перещеплення пухлини. В кожний термін спостереження досліджували 5-7 тварин. Кількість нейрамінової кислоти в динаміці росту пухлини визначали за допомогою резорцин-перйодатного методу [Прохорова М.И., 1982]. Кількість метастазів у легенях підраховували візуально. Для всіх інших дослідів брали пухлинну тканину в період з 15 по 18 добу після перещеплення. Кожний дослід повторювали не менше 5-ти разів, для кожного разу брали групу з 10-ти тварин.

Виявлення на поверхні злоякісних клітин ендогенних лектинів.Пухлинні клітини для дослідження експресії лектинів культивували протягом 24, 48 і 72 годин за рутинною методикою. Цитологічні препарати виготовляли за методикою, описаною в монографії Глузмана Д.Ф. з співавт. (2000). У роботі використані 22 вуглеводних зонда, що були синтезовані і люб'язно надані Н.В.Бовіним і співроб. (Інститут біоорганічної хімії ім. М.М.Шемякіна РАН), які являють собою водорозчинний біотинильований поліакриламід, що містить залишки моно- чи олігосахаридів [Bovin N.V. et al., 1990]. Зонди розчиняли у фізіологічному розчині, який був забуферений фосфатним буфером (ЗФР) з рН 7,2-7,4, і використовували в концентрації 1 мг/мл за методикою Абраменко І.В. з співавт. (1993). Продукт реакції оцінювали за допомогою імерсійної системи світлооптичного мікроскопа. Оскільки у використаних злоякісних клітинах ендогенна пероксидазна активність була відсутня, її пригнічення не проводили. Суспензія виділених клітин пухлини була однорідною за розміром і ступенем диференціювання, що і виявлялося в зв'язуванні вуглеводних зондів: рецептори поверхні клітин зв'язували зонд з однаковою інтенсивністю і не менш ніж на 94% клітинної популяції. Зв'язування зондів внутрішньоклітинними органоїдами не відмічено. Для перевірки специфічності зв'язування зонда відповідним лектином зроблені наступні контролі: 1) інкубація препарату з біотинильованим поліакриламідним зондом, що несе вуглеводну детермінанту, до якої відомо відсутній рецептор (у даній роботі з цією метою використовувався зонд з залишками полімеру β-глюкози); 2) інкубація препарату у середовищі з рН 7,2-7,4 замість біотинилиьованого поліакриламідного зонда; 3) нанесення на препарат тільки інкубаційної суміші для виявлення активності пероксидази.

Виявлення на поверхні клітин селезінки ендогенних вуглеводів до рослинних лектинів.Фракцію клітин-імуносупресорів селезінки одержували за модифікованою методикою седиментаційного виділення агрегатів лімфоїдних клітин і макрофагів [McIntyre G.A. et al., 1973]. На 15 добу після перещеплення пухлини з початку появи імуносупресорної активності у мишей видаляли селезінку і розтирали в гомогенізаторі. Отриманий гомогенізат відмивали від дебриса і виділяли агрегати лімфоїдних клітин і макрофагів фракціонуванням на ступеневому градієнті (50, 75 і 100%) інактивованої бичачої сироватки протягом 2-х годин при 4оС. Через дві години нижню агреговану фракцію градієнта відмивали від сироватки і використовували для одержання цитологічних препаратів.

У роботі були використані лектини, кон'юговані з пероксидазою хрону ("Лектинотест", Україна). Визначення робочої концентрації кон'югатів, одержання цитологічних