LibRar.Org.Ua — Бібліотека українських авторефератів

Загрузка...

Головна Медицина. Медичні науки → Роль ендогенних лектинів і вуглеводнів в агрегації, адгезії і міграції злоякісних клітин

препаратів, проведення цитохімічної реакції і виявлення активності пероксидази проводили, як описано в роботі Глузмана Д.Ф. з співавт., (2000). Продукт реакції оцінювали за допомогою імерсійної системи світлооптичного мікроскопа. Оскільки у фракції клітин селезінки ендогенна пероксидазна активність була відсутня, її не інгібували. Використана в роботі фракція клітин селезінки з імуносупресуючою активністю була гетерогенною. Тому рослинні лектини зв'язувалися з цими клітинами в різних процентних співвідношеннях. Були використані такі контролі: 1) інкубація препарату в середовищі з рН 7,2-7,4 замість рослинного лектина; 2) нанесення на препарат тільки інкубаційної суміші для виявлення активності пероксидази.

Модельна система для вивчення впливу вуглеводів на агрегацію злоякісних клітин.У роботі було використано 15 вуглеводів, з кінцевою концентрацією у середовищі культивування 1 μМ. Вплив вуглеводів на агрегацію злоякісних клітин оцінювали за зміною кількості клітинних агрегатів у відсотках у порівнянні з контролем. Агрегацію клітин у суспензії оцінювали за допомогою інвертованого мікроскопа на 7 добу культивування. Агрегацію злоякісних клітин на субстраті вивчали при культивуванні на міліпорових фільтрах. Для цього на дно кожної лунки 24-х луночного планшету розміщували нітроцелюлозні фільтри відповідного діаметра з розміром пор 0,22 мкм ("Millipore", США), на які висівали 106/мл пухлинних клітин. На 7 добу фільтри фіксували, фарбували гематоксиліном по Бемеру і оцінювали кількість агрегатів на світлооптичному мікроскопі.

Модельна система для вивчення впливу вуглеводів на міграцію злоякісних клітин з біоптатів.Біоптати об'ємом 2мм3 наносили на нітроцелюлозні фільтри ("Millipore", США) з діаметром пор 0,22 мкм і культивували протягом 2 діб. Термін 2 доби був обраний як оптимальний час інкубації, що дозволяв одержати максимальну площу міграції клітин за відсутності проліферації. Після 48 годин культивування фільтри з біоптатами фіксували, забарвлювали гематоксиліном по Бемеру. Міграцію пухлинних клітин на субстраті оцінювали за допомогою світлового мікроскопа за площею поширення клітин навколо біоптата, включаючи площу самого біоптата. При аналізі площі міграції клітин, яку оцінювали в ум.од., на поверхні фільтра враховували тільки області правильної округлої форми.

Для вивчення впливу вуглеводів на міграцію злоякісних клітин час культивування був збільшений до 7 діб. Виділені з пухлинного вузла на 15-18 добу після перещеплення біоптати залишали на ніч для адаптації і на наступний день вносили в середовище культивування вуглеводи з кінцевою їх концентрацією 1 μМ. Через 2 доби середовище змінювали і знову вносили вуглеводи. На 7 добу фільтри з біоптатами фіксували та забарвлювали. При такій тривалості культивування біоптатів відбувалась не тільки міграція пухлинних клітин, але і їх проліферація. Міграцію пухлинних клітин з біоптату на 7 добу культивування оцінювали, підраховуючи кількість клітин у полі зору від краю біоптата за допомогою світлового мікроскопа. При аналізі враховували області міграції тільки правильної округлої форми.

Культивування злоякісних клітин та біоптатів і клітин селезінки в дифузійних камерах. Для вивчення впливу вуглеводів на міграцію і агрегацію пухлинних клітин в присутності клітин селезінки використана модельна система подвійних дифузійних камер. На простерилізовані кип'ятінням фільтри наносили клітини і асептично монтували камери. До нижньої частини камери вносили 106 пухлинних клітин на мл середовища RPMI-1640. Виділені на ступеневому градієнті інактивованої бичачої сироватки клітини селезінки вносили у верхню частину камери. Співвідношення пухлинних і лімфоїдних клітин при спільному культивуванні складало 1:4. На 7 добу культивування фільтри знімали з камер, фіксували і забарвлювали. Контролем були використані камери з клітинами селезінки без пухлинних клітин і камери з клітинами пухлин без клітин селезінки.

Статистичну обробку даних проводили з використанням t-критерію Стьюдента за допомогою програми Microcal Origin.


РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ


Експресія ендогенних лектинів на поверхні злоякісних клітин різного генезу. Були виявлені відмінності в експресії ендогенних лектинів на поверхні клітин спонтанно метастазуючої меланоми В16 і неметастазуючої МХА саркоми. Експресія ендогенних лектинів на поверхні клітин меланоми В16 досліджувалась через 1, 24, 48 і 72 години після виділення. Через годину після трипсинізації на поверхні клітин меланоми виявлено зв'язування тільки двох з двадцяти двох використаних вуглеводних зондів – з залишками манози і фосфорильованної манози. Очевидно, це найбільш стабільні до впливу трипсину структури клітинної поверхні. Максимальна експресія рецепторів (12 з 22-х досліджених вуглеводних зондів) спостерігалася через 24 години культивування . При цьому експресія лектинів до залишку галактози була слабко вираженою; до залишків манози, фосфату манози, фукозил-глюкозаміна і галактозил-(-фукозил)-галактози – помірно вираженою; до галактозамініл-галактози і галактозамініл-(-фукозил)-галактози – середне вираженою; до нейрамінової кислоти, фукозил-галактози, галактозил-глюкозаміна, α-галактозил-галактозаміна, фукозил-глюкозаміна – сильно вираженою. Таким чином, на поверхні клітин меланоми В16 виявлена експресія лектинів зі специфічністю до п'яти фукозильованих залишків. Експресія лектинів до нейрамінової кислоти була виявлена на поверхні агрегованих клітин меланоми В16 в місцях міжклітинних контактів. При достовірній відсутності лектинів до простого галактозаміну на поверхні клітин меланоми В16 виявлені лектини до галактозамінованих залишків ди- і трисахаридів: галактозамін-галактози, антигену Томсена-Фриденрайха і антигенам A і B, що, можливо, пов'язано зі здатністю лектинів проявляти більшу спорідненість до полівалентних детермінантів, ніж до моновалентних [Weis W.I. et al., 1996].

Через 48 та 72 години культивування кількість лектинів, що виявляються, знову різко знижувалась. З усіх використаних зондів достовірне зв'язування відзначене тільки для фосфорильованого залишку манози. "Зникнення" лектинів з поверхні клітин меланоми, може бути пов'язано з маскуванням вуглеводних структур клітинної поверхні при відновленні поверхневих детермінант клітин після трипсинизації.

Оскільки на клітинах меланоми В16 максимальна експресія рецепторів до вуглеводних зондів спостерігалася через 24 години після трипсинізації, то експресію ендогенних лектинів на поверхні клітин МХА саркоми вивчали в той же термін. Надалі при вивченні впливу вуглеводів на агрегацію, адгезію і міграцію клітин меланоми В16 і карциноми 3LL, додавали вуглеводи в середовище культивування пухлинних клітин також через 24 години після трипсинізації.

Порівняльний аналіз експресії лектинів на поверхні агрегованих клітин метастазуючої меланоми В16 і неметастазуючої МХА саркоми виявив, що спектр експресії лектинів до шести моносахаридних зондів та інтенсивність їх зв'язування слабо відрізнялись. На поверхні обох типів клітин не виявлено лектинів до залишків глюкози, глюкозаміна і галактозаміна. Експресія лектинів до залишків манози і фосфорильованної манози була помірно вираженою як на клітинах меланоми В16, так і МХА саркоми. Експресія лектинів до залишку галактози, що була слабко виражена на клітинах меланоми В16, на клітинах МХА саркоми взагалі була відсутньою. На клітинах неметастазуючої МХА саркоми не виявлено лектинів до залишку нейрамінової кислоти, при його