LibRar.Org.Ua — Бібліотека українських авторефератів

Загрузка...

Головна Медицина. Медичні науки → Роль ендогенного оксиду азоту в патогенезі периферичної полінейропатії при експериментальному цукровому діабеті (експериментальне дослідження)

робіт – у збірниках конференцій та симпозіумів та тези. Надруковані практичні рекомендації, інформаційний лист, одержано 3 патенти України на винахід.

Структура і обсяг дисертації. Робота представлена на 164 сторінках машинописного тексту. Складається з введення, огляду літератури, списку матеріалів і методів досліджень, п'яти глав опису результатів власних досліджень, аналізу та узагальненню результатів, висновків і списку використаної літератури. Дисертація ілюстрована 32 таблицями та 7 рисунками. Список літератури містить 288 джерел, з них 216 - на іноземних мовах.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень. Експериментальні дослідження були виконані в умовах хронічного експерименту на 510 статевозрілих щурах лінії Вістар масою 180-250 г; досліди виконували згідно положень, викладених у "Основних методах вивчення токсичності потенційних фармакологічних препаратів" (Фармкомітет України, Київ, 2000).Роботу з лабораторними тваринами проводили, додержуючись норм проведення дослідів, прийнятих комісією з етики проведення експериментальних досліджень ОДМУ, та правил, що передбачені Європейською комісією з нагляду за проведенням лабораторних та інших дослідів з участю експериментальних тварин різних видів.

Експериментальний цукровий діабет (ЕЦД) відтворювали у щурів при в/очер введенні СТЗ (60 мг/кг; "Serva", Німеччина), який розчиняли в натрієвому цитратному буфері (рН=4,5). Введення СТЗ призводить до вибіркової загибелі b-клітин ПЗ (Biessels G.J. et al., 2001). Окрім цього, в паренхімі ПЗ морфологічно відзначається некроз та загибель 67-80% b-клітин, у решти клітин відмічався незначний набряк із збереженнням функціональної активності. Формування ЕЦД перевіряли на 2 добу після введення СТЗ шляхом визначення концентрації глюкози в крові щурів, отриманої з хвостової вени, за допомогою індикаторної тест-смужки ('One Touch', Німеччина; погрішність методу становила 1 %). Для подальших експериментів обиралися лише ті щури, концентрація глюкози в крові яких перевищувала 15 ммоль/л. Ефективність моделювання ЕЦД становила 92-95 %. За щурами спостерігали 6 тижнів без лікування (цей часовий інтервал є достатнім для формування ЕДПП; Vinik A.I. et al., 2001), після чого розпочинали лікування.

Формування ЕДПП підтверджували морфологічним дослідженням хвостового нерву. Для проведення морфологічних досліджень кожний тиждень умертвляли по 2-3 тварини з кожної з груп, у щурів вилучали хвостовий нерв, промивали ізотонічним розчином NaCl і клали у 5 % розчин формаліну. Вилучені нерви піддавали дії спиртів зі зростаючою концентрацією, потім їх заливали у целуїдін. З блоків готували зрізи завтовшки 7-9 мкм, забарвлювали гематоксиліном, еозином і тіоніном за Нісслем. Якісні морфологічні зміни оцінювали за допомогою світлового мікроскопу МБІ-15. При морфологічному дослідженні хвостового нерву у щурів відзначалися набряк та дегенерація шванівських клітин, а також сегментарна демієлінізація, які мали периаксональний характер. До кінця 6 тижнів з момента введення СТЗ відмічалися набряк ядра шванівських клітин та поява жирових крапель в їх цитоплазмі. Мієлінова оболонка периферичного нерва втратила правильні контури. Прекапілярні артеріоли хвостового нерва переважно спазмовані, відмічаються в полі зору зі втратою внутрішньоклітинних органел.

Препарати з лікувальною метою щурам з ЕДПП вводили, починаючи з 7 тижня протягом подальших 4 тижнів (до 10 тижнів досліду) одноразово, внутрішньоочеревинно (в/очер), двічі на тиждень (на 2 та 5 добу). З профілактичною метою препарати вводили одноразово двічі в тиждень з 1 по 6 тижні досліду (на 2 та 5 добу).

Експерименти виконували в наступних групах тварин: 1 група - інтактні щури (контроль); 2 група - щури з ЕДПП; 3 група - щури з ЕДПП, яким вводили пентоксифілін (100 мг/кг, в/очер) з лікувальною метою; 4 група - щури з ЕДПП, яким вводили пентоксифілін (100 мг/кг, в/очер) з профілактичною метою; 5 група - щури з ЕДПП, яким вводили ЛК (50 мг/кг, в/очер) з лікувальною метою; 6 група - щури з ЕДПП, яким вводили ЛК (50 мг/кг, в/очер) з профілактичною метою; 7 група - щури з ЕДПП, яким вводили цилостазол (5,0 мг/кг, в/очер) з лікувальною метою; 8 група - щури з ЕДПП, яким вводили цилостазол (5,0 мг/кг, в/очер) з профілактичною метою; 9 група - щури з ЕДПП, яким вводили NG-нітро-L-аргінін (20 мг/кг, в/очер) з лікувальною метою; 10 група - щури з ЕДПП, яким вводили NG-нітро-L-аргінін (20 мг/кг, в/очер) з профілактичною метою.

До кожної з названих груп надходило не менше 10 тварин (виняток становили експерименти по дослідженню швидкості проведення збудження (ШПЗ) по периферичному нерву; при цьому в кожній групі було по 6 щурів).

З профілактичною метою тестували ефекти досліджуваних препаратів протягом 1-6 тижнів з моменту введення СТЗ.

Масу тіла щурів визначали за допомогою механічних лабораторних терезів; погрішність зважування складала 1 г.

В окремих спостереженнях у щурів визначалиШПЗ (м/с) по хвостовому нерву1 за методикою Biessels G.J. et al. (2001). Для цього у наркотизованих етаміналом натрію (30 мг/кг) щурів подразнювали монополярно крізь голковий електрод прямокутними поштовхами струму 400-450 мкА (тривалість 0,1 мс); викликаний масовий потенціал дії (хвилю збудження) відводили аналогічним електродом на відстані 8-14 см від місця подразнення. Референтний електрод знаходився в прямій кишці. Реєстрацію здійснювали за допомогою електронного осцилографа та фотореєстратора (ФОР-2).

В окремій серії експериментів після евтаназії (надмірною дозою етамінала натрію, 100 мг/кг) у тварин збирали кров, в якій визначали суму метаболітів NO - нітриту (NO2-) та нітратів (NO3-). Враховуючи нестійкість NO2- та його легку здатність окислюватися до NO3-, нітрат-іон відновлювали до нітрит-іона за допомогою металевого кадмію, імпрегнованого міддю; концентрацію NO2- визначали за допомогою реактиву Грейса (Green L.C. et al., 1982).

У крові та гомогенатах ПЗ щурів загальноприйнятими методами визначали концентрацію малонового диальдегіду (МДА), дієнових кон'югатів (ДК) (Коган В.С. и соавт., 1988; Андреева Л.И. и соавт., 1998), а також активність антиоксидантних ферментів. Активність каталази оцінювали колориметрично, СОД вимірювали за ступенем її інгібірування відновлення нітросинього тетразолія у присутності NADH та феназін-метасульфата (Дубинина Е.Е. и соавт., 1983), глутатіонпероксидази - за швидкістю окислення глутатіону у присутності гідроперекису третинного бутилу (Моин В.М., 1986), а NADРH-глутатіонредуктази - за швидкістю відновлення окисленого глутатіону у присутності NADРH (Власова С.Н. и соавт., 1990). Вміст відновленого глутатіону визначали за методикою Прохорової М.І. (1982). З природних антиоксидантів, що відносяться до неферментної системи антиоксидантного захисту, досліджували концентрацію a-токоферолу за методом Кисилевич Р.Ш., Скварко С.И. (1972) в модифікації Рудакової-Шиліної Н.К., Матюхової Н.П. (1982). Метод заснований на здатності a-токоферолу давати кольорову реакцію у присутності 2,2-діпіріділу та іонів трьохвалентого заліза. Інтенсивність розвинутого в ході реакції забарвлення реєстрували спектрофотометрично при